Kultur Jaringan

2.1 Kultur Jaringan

Kultur   jaringan   dalam  bahasa   asing   disebut sebagai tissue culture.  Kultur adalah budidaya dan  jaringan adalah sekelompok sel yang  mempunyai   bentuk   dan   fungsi   yang   sama.   jadi,   kultur   jaringan   berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya (Suryowinoto,1991). 

Pelaksanaan  teknik kultur   jaringan  ini  berdasarkan  teori   sel   seperti  yang ditemukan   oleh   Scheiden   dan   Schwann,   yaitu   bahwa   sel  mempunyai   kemampun autonom, bahkan mempunyai kemampuan totipotensi. Totipotesi adalah kemampuan setiap sel,  dari  mana saja sel   tersebut  diambil,  apabila diletakan dalam  lingkungan yang   sesuai   akan   dapat   tumbuh  menjadi   tanaman  yang   sempurna   (Suryowinoto, 1985).

Kultur   adalah   budidaya   sementara   jaringan   adalah   sekelompok   sel   yang mempunyai   bentuk     dan   fungsi   yang   sama.   Sehingga   kultur   jaringan   adalah membudidayakan  jaringan  tanaman  menjadi   tanaman  kecil  yang mempunyai   sifat seperti induknya. (Daisy. P dan Wijayani. A: 1994).

Kultur jaringan adalah suatu metode penanaman protoplas, sel, jaringan, dan organ pada media buatan dalam kondisi aseptik sehingga dapat beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Salah satu aplikasi kultur jaringan yang telah dikenal secara meluas dan  telah banyak diusahakan untuk  tujuan komersial  adalah perbanyakan  tanaman Perbanyakan melalui kultur jaringan yang banyak diusahakan secara komersial pada saat   ini   terutama   di   negara-negara   maju   seperti   Amerika,   Jepang,   dan   Eropa Berdasarkan   hasil   percobaan   Morel   pada   tahun   1960   pada   tanaman   anggrek Cymbidium dan tanaman hias lainnya, dalam waktu singkat dari bahan tanaman yang sangat   terbatas  menghasilkan   tanaman   baru yang   sangat  banyak.  Hasil   penelitian tersebut telah merangsang para peneliti untuk menerapkannya pada tanaman lain.

Kultur   jaringan  merupakan   salah   satu   cara   perbanyakan   tanaman   secara vegetatif.   Kultur   jaringan  merupakan   teknik   perbanyakan   tanaman   dengan   cara mengisolasi  bagian  tanaman seperti  daun,  mata  tunas,  serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri  dan bergenerasi  menjadi   tanaman  lengkap.  Prinsip utama dari teknik   kultur   jaringan   adalah   perbanyakan   tanaman   dengan  menggunakan   bagian vegetatif   tanaman   menggunakan   media   buatan   yang   dilakukan   di   tempat steril. (Daisy. P dan Wijayani. A: 1994).

Menurut Sagawa (1998), penggunaan metode kultur dapat mempercepat perbanyakan vegetatif dan generatif, mempermudah seleksi mutan, menghindarkan sterilisasi yang menghambat hibridasi, menghasilkan tanaman bebas patogen dan dapat melestarikan plasma nutfah.

Embriogenesis dimulai dengan pembelahan gel yang tidak seimbang (kalus). Kalus biasanya terbentuk setelah eksplan dikulturkan dalam media yang mengandung auksln Banyak faktor yang mempengaruhi embriogenesis antara lain auksin eksogen, sumber eksplan, komposisi nitrogen yang ditambahkan dalam media dan karbohidrat (sukrosa).  Selanjutnya gel  membelah  terus hingga memasuki   tahap globular.  Pada saat tersebut sel aktif membelah kesegala arah dan membentuk lapisan terluar yang akan menjadi protoderm (bakal epidermis), kelompok sel yang merupakan prekursor jaringan dasar dan jaringan pembuluhpun mulai terbentuk. Pembelahan kesegala arah tersebut terhenti ketika pembentukan primordia kotiledon,  pada saat embrio matang sudah   autotrof.   Embrio   yang   matang   akan   berkecambah   dan   tumbuh   menjadi tumbuhan yang baru pada kondisi yang cocok (Bajaj, 1994; Dodeman dkk. 1997;Lits, 1985).

Proses   pembentukan   dan   perkembangan   embrio   (embriogenesis) menentukan   pola   pertumbuhan,   yaitu  meristem  pucuk   ke   atas,  meristem  akar   ke bawah, dan pola-pola dasar jaringan lainnya berkembang pada 'axis' pucuk -akar ini, namun pada tiap tumbuhan terdapat variasi pada proses embriogenesis.

Pada metode kultur jaringan terbukti gel somatik yang terbentuk dari gel-gel embriogenik   dapat   juga  melakukan   proses   embriogenesis.  Fenomena   ini   berhasil diamati   pada   tahun   50-an   pada   beberapa   tanaman,   seperti   kedelai,   jagung,   dan terutama pada wortel. Korteks wortel yang ditanam pada media dasar 'white', sukrosa dan 2.4-D membentuk massa kalus, yang kemudian dipindahkan ke media tanpa 2.4-D   ternyata   sekumpulan   gel   membelah   teratur   dan   melalui   tahap   normal embriogenesis yaitu globular, jantung, dan torpedo,kemudian menjadi tanaman baru yang  lengkap.  Hasil  penelitian  ini  membuktikan bahwa setiap gel  pada  tumbuhan masih memiliki kapasitas yang dipunyai oleh zigot dari mana gel tersebut berasal jadi hanya dengan memberikan rangsangan yaitu berupa lingkungan yang cocok (terutama dari  media   tempat   gel   kultur),  maka   gel   tersebut   akan  mampu  mengekspresikan potensi untuk tumbuh dan berkembang menjadi individu baru (Bajaj, 1994).

2.2 Tahapan-tahapan dalam Teknik Kultur Jaringan

Menurut Af’idah (2009), bahwa beberapa tahapan yang dilakukan dalam teknik kultur jaringan yaitu : sterilisasi, pembuatan media, inisiasi, multiplikasi, pengakaran kemudian aklimatisasi.

Sterilisasi merupakan kegiatan untuk mensterilkan semua peralatan dan bahan yang akan digunakan dalam kultur jaringan. Hal ini bertujuan untuk menghindari adanya mikroba kontaminan yang dapat menyebabkan kerusakan pada kultur (Amalia, 2009).

Pembuatan media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.  Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon.  Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain.  Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, bergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan.  Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf (Af’idah, 2009).

Amalia (2009), menyatakan bahwa inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas atau daun.

Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan.  Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar (Af’idah, 2009).

Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik.  Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri) (Af’idah, 2009).

Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng (tempat). Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif (Af’idah, 2009).

2.3  Zat Pengatur Tumbuh

            Zat pengantur tumbuh adalah senyawa organic bukan nutrisi tanaman yang aktif dalam jumlah kecil yang disintensiskan pada bagian tertentu tanaman dan pada umumnya   diangkut   ke   bagian   lain   tanaman   dimana   Zat   tersebut  menimbulkan tanggapan   secara  biokimia,fisiologis   dan morfologis.  Zat  pengantur   tumbuh  yang umumdigunakan   dalam   kultur   in   vitro   adalah   golongan   auksin   dan   sitokinin (Wattimena, 1988).

            Zat pengatur tumbuh (ZPT) memainkan peranan yang penting melalui pengaruhnya pada pembelahan sel dan diferensiasi sel selama terjadinya perkembangan dari zigot sampai perkecambahan biji, pertumbuhan vegetatif dan reproduktif. ZPT alami dan senyawa buatan adalah zat yang dapat mengubah pertumbuhan dan perkembangan tanaman, nama senyawa tersebut dapat juga pada kegiatan fisiologisnya, misal : Zat tumbuh daun, akar, dsb.

            More (1989), membedakan antara hormon tanaman dan zat pengatur tumbuh (ZPT) sebagai berikut :

a.       Hormon tanaman adalah senyawa organik bukan nutrisi yang aktif dalam jumlah kecil (<1 mM) yang disintesis pada bagian tertentu, umumnya ditranslokasikan ke bagian lain tanaman dimana senyawa tersebut menghasilkan suatu respon secara biokimia, fisiologis dan morfologis.

b.      Zat pengatur tumbuh (ZPT) adalah senyawa organik bukan nutrisi yang dalam konsentrasi rendah (<1 mM) mampu mendorong, menghambat atau secara kualitatif mengubah pertumbuhan dan perkembangan tanaman.

            Agar hormon tumbuhan yang terdapat dalam jumlah yang relatif sangat kecil bersifat aktif dan khas, dapat di pastikan harus ada tiga syarat utama dalam sistem respon. Yang pertama, hormon harus ada dalam jumlah yang cukup dalam sel yang tepat. Kedua, hormon harus dikenali dan diikat erat oleh setiap kelompok sel yang tanggap terhadap hormon (sel sasaran yang peka). Dan untuk ini diperlukan protein penerima yaitu suatu protein yang memiliki struktur komplek yang dapat mengenali dan memilih diantara molekul yang jauh lebih kecil. Ketiga, protein penerima tersebut (konfigurasinya diduga berubah saat menerima hormon) harus dapat menyebabkan perubahan metabolik lain yang mengarah pada penguatan isyarat atau kurir hormon (Untung,2001).

            Frank dan Ceon (1995), menyatakan bahwa hormon tumbuhan adalah senyawa organik yang disintesis oleh salah satu bagian tanaman dan dipindahkan ke bagian tanaman yang lain. Pada konsentrasi yang sangat rendah hormon mampu menimbulkan suatu respon fisiologis, dan juga menyatakan bahwa hormon yang sudah dikenal sampai sekarang hanya ada 5 kelompok walaupun masih banyak lagi yang dipastikan di temukan. Kelima kelompok yang sudah di kenal itu meliputi 4 macam auksin, berbagai macam giberellin (tercatat 86 macam), beberapa sitokinin, asam absisat dan etilen.

            Titik-titik dalam proses ekspresi gen yang menunjukkan bagaimana aktivitas atau peran hormon pada prinsipnya dapat dikelompokkan atas peran hormon pada membran, substrat dan pada enzim.

1.      Hormon mempengaruhi permeabilitas membran. Pengaruhnya dapat meningkatkan atau menurunkan. Bila permeabilitasnya meningkat maka akan mengakibatkan kemampuan selektivitas menurun, sehingga memacu masuknya ion-ion atau senyawa-senyawa ke dalam sel. Sedangkan bila permeabilitasnya menurun maka akan mengakibatkan selektifitas meningkat sehingga akan mengurangi masuknya ion-ion atau senyawa tertentu ke dalam sel. Kemampuan selektivitas memungkinkan masuknya ion tertentu dan menghambat ion yang lain, sehingga konsentrasi ion tertentu di dalam sel akan meningkat dibandingkan dengan di luar sel. Artinya bahwa substrat di luar sel tidak sama dengan substrat di dalam sel.

2.      Hormon mampu menghambat atau mempercepat terbentuknya kompleks enzim-substrat, artinya dengan posisi demikian hormon mempunyai peran dapat mendorong percepatan reaksi enzimatik atau menghambat. Pada reaksi enzimatik agar terbentuk produk, terlebih dahulu substrat harus berikatan dengan enzim membentuk kompleks-enzim-substrat.

3.      Hormon dapat mempercepat penyediaan atau pembentukan : atp. Koenzim, kofaktor, dan vitamin pada reaksi enzimatik, karena efektifitas kerja enzim sangat memerlukan hal-hal di atas.

4.      Hormon sendiri berfungsi sebagai koenzim, sehingga enzim yang sebelumnya tidak aktif menjadi aktif berfungsi. Untuk dapat aktif enzim memerlukan koenzim, atau dapat pula hormon itu hanya berfungsi sebagai pengaktif saja.

5.      Hormon berfungsi sebagai pengaktif, jika pada enzim terdapat inhibitornya. Seperti diketahui bahwa enzim dapat menjadi tidak aktif bila terdapat hambatan (inhibitor). Bila yang terjadi adalah inhibitor kompetitif hormon dapat membantu dengan cara meningkatkan konsentrasi substrat atau enzimnya. Sedangkan bila yang terjadi adalah inhibitor non kompetitif maka hormon bertindak sebagai penangkap atau pengikat inhibitor nin kompetitifnya hingga hambatan menurun dan reaksi berjalan.

6.      Hormon dapat berperan sebagai pengaktif prekrusor enzim, dalam hal ini hormon berperan sebagai scond massenger pada sistesis protein sehingga percepatan reaksi dapat terjadi.

7.      Hormon sebagai pengatur efek allosterik (sebagai efektor),

8.      Hormon dapat mempengaruhi langsung dalam aktifitas sintesis protein. (Untung,2001).

2.4 Manfaat Kultur in Vitro

            Menurut Santoso (1998), manfaat kultur in Vitro adalah :

1.      Dapat mengatasi perbanyakan tanaman yang persentase perkecambahan bijinya rendah.

2.      Dapat mengatasi perbanyakan tanaman yang sulit membentuk biji.

3.      Dapat memperpendek waktu perbanyakan tanaman yang masa reproduksinya membutuhkan waktu yang lama.

4.      Mempermudah usaha perbanyakan dan pemuliaan tanaman secara umum selalu diperbanyak dengan cara vegetatif.

5.      Untuk mendapatkan tanaman yang toleran pada stress lingkungan tertentu.

6.      Untuk mendapatkan tanaman yang bebas dan bahkan tahan terhadap serangan mikroorganisme.

7.      Dapat membantu proses konservasi plasma nurfah.

Menurut untung (2001), tujuan sel yang paling banyak dilakukan adalah dalam rangka untuk :

1.    Mendapatkan klon tanaman yang berasal dari sel tunggal.

2.    Untuk membuat mutasi yang seragam kemudian seleksi mutan.

3.    Untuk mendapatkan ekstraksi senyawa sekunder.

4.    Untuk keperluan penggandaan kromosom (chromosome doubling).

Sedangkan kultur kalus bertujuan untuk memperoleh kalus dari eksplan yang di isolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan mampu memperbanyak dirinya (mengganda massa selnya) secara terus-menerus. Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel parenkim yang mempunyai ikatan renggang dengan sel-sel lainnya.

Manfaat dari kultur jaringan secara in vitro bagi perbanyakan tanaman adalah :

a.       Pengadaan bibit tidak tergantung musim

b.      Bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyak dengan waktu yang relatif lebih cepat (dari satu mata tunas yang sudah respon dalam 1 tahun dapat dihasilkan minimal 10.000 planlet/bibit)

c.       Bibit yang dihasilkan seragam

d.      Bibit yang dihasilkan bebas penyakit (meng gunakan organ tertentu)

e.       Biaya pengangkutan bibit relatif lebih murah (Anonimous, 2009)..

2.5 Media Tanam Kultur Jaringan

Unsur-unsur yang Dibutuhkan Tanaman Sebelum menguraikan   cara-cara  membuat  medium  kultur   jaringan,  maka terlebih   dahulu   kita   harus   mengetahui   unsur-unsur   yang   dibutuhkan   untuk pertumbuhan   tanaman.   Unsur-unsur   yang   dibutuhkan   tanaman   dikelompokkan menjadi:

1. Garam-garam Anorganik

Setiap tanaman membutuhkan paling sedikit 16 unsur untuk pertumbuhannya yang normal. Tiga unsur di antaranya adalah C,H,O yang di ambil dari udara, sedangkan 13 unsur yang  lain berupa pupuk yang dapat diberikan melalui akar atau melalui daun.  Pada perbanyakan  tanaman secara kultur   jaringan.  Semua unsur   tersebut dibutuhkan   oleh   tanaman   untuk   pertumbuhannya.   Ada   unsur   yang   dibutuhkan tanaman dalam jumlah besar yang disebut unsur makro, ada pula yang dibutuhkan oleh tanaman dalam jumlah sedikit tetapi harus tersedia yang disebut unsur mikro.

2. Zat-zat Organik

Zat-zat organik yang biasanya ditambahkan dalam medium kultur jaringan adalah sukrosa,  mio inositol, asam amino,  dan  zat pengatur tumbuh. Sedangkan sebagai tambahan biasanya diberi zat organik lain seperti air kelapa, ekstrak ragi, pisang, tomat, toge dan lain-lain.

2.5.1 Kegunaan Setiap Unsur Bagi Tanaman

            Menurut Sutami (1989), kegunaan tiap unsur-unsur bagi petumbuhan tanaman atau jaringan tanaman adalah sebagai berikut :

1. Unsur Nitrogen (N), Kegunaan unsur Nitrogen bagi tanaman adalah untuk penyuburkan tanaman, sebab unsur N dapat membentuk protein, lemak dan berbagai persenyawaan organik yang lain.

2. Unsur Fospor (P), Dibutuhkan oleh tanaman untuk membentuk karbohidrat. Maka,  unsur P ini dibutuhkan secara besar-besaran pada waktu pertumbuhan benih.

3. Unsur Kalium (K), Memperkuat untuk tubuh tanaman, karena unsur ini dapat digunakan untuk memperkuat  serabut-serabut  akar,  sehingga daun,  bunga dan buah  tidak mudah gugur.

4. Unsur Sulpur (S), Unsur   ini   digunakan   untuk   proses   pembentukan   anakan   sehingga pertumbuhan dan ketahanan tanaman terjamin.

 5. Unsur Kalsium (Ca), Digunakan untuk merangsang pembentukkan bulu-bulu akar,  mengeraskan batang dan merangsang pembentukkan biji.

6. Unsur Magnesium (Mg), Digunakan tanaman sebagai bahan mentah untuk ppembentukkan sejumlah protein.

7. Unsur Besi (Fe, Unsur ini digunakan sebagai penyangga (chelati agint) yang sangat penting untuk menyagga kestabilan   pH media selama digunakan untuk  menumbuhkan jaringan tanaman.

8. Unsur Sukrosa, Unsur ini sering ditambahkan pada medium kultur jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus.

9. Unsur Glukosa atau Fruktosa, Unsur   ini  dapat  digunakan sebagai  unsur  pengganti  sukrosa karena dapat merangsang beberapa jaringan.

10. Unsur Mio-inositol, Penambahan unsur ini pada medium bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan.

11. Unsur Vitamin, Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam mediumklutur jaringan antara lain adalah Thiamin. Thiamin adalah vitamin esensial yang digunakan   untuk medium kultur jaringan. Fungsi dari tiamin adalah untuk mempercepat pembelahan sel pada meristem akar, juga berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang menghasilkan energi dari karbohidrat dan memindahkan energi.

12. Unsur Asam Amino, Unsur ini diunakan oleh tanaman untuk proses pertumbuhan dan diferensiasi sel. Kebutuhan unsur asam amino oleh tanaman berbeda.

2.6 Bentuk Fisik Media Tanam

Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan. Bahan-bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula , vitamin, protein, dan hormon tumbuh. media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media cair berarti campuran-campuran zat kimia dengan air  suling,  sedangkan media padat  adalah media zat  cair   tesebut ditambah dengan zat pemadat agar.